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    1. 公司產品

      shRNA質粒載體

      shRNA表達載體帶有抗生素標記,可以在細胞中持續抑制靶基因的表達,持續數星期甚至更久。對于一個已知有效的siRNA序列(例如,經過siRNA合成方法篩選獲得的),需要維持較長時間的基因沉默時,推薦使用shRNA載體系統。

      產品描述

      shRNA表達載體帶有抗生素標記,可以在細胞中持續抑制靶基因的表達,持續數星期甚至更久。對于一個已知有效的siRNA序列(例如,經過siRNA合成方法篩選獲得的),需要維持較長時間的基因沉默時,推薦使用shRNA載體系統。吉瑪致力于提供最先進和最方便的shRNA相關工具,最近推出新一代shRNA表達質粒,一種高效即用型載體,該載體在細胞內可以持續產生shRNAs,從而達到持久抑制目標基因表達的目的。

      吉瑪 supersilencingTM shRNA表達載體系統



      shRNA表達載體系統特點:
      產生短發夾型RNA(shRNA)來完成RNA干擾
      方法簡單、經濟實惠,只需合成DNA寡核苷酸克隆載體使用方便,帶有篩選標記
      克隆載體使用方便,帶有篩選標記
      shRNA質粒穩定,易于操作



      GenePharma supersilencingTM shRNA表達載體特點:

      1、克隆載體具有兩種形式的克隆酶切位點BbsⅠ BamHⅠ。

      BbsⅠ是特殊的限制性內切酶,產生非對稱互補粘性末端,保證插入片斷的方向正確,防止載體自體連接。

      2、shRNA多種篩選標記可幫助建立穩定轉染細胞系 

      Neo :Neomycin耐受基因 
      Hygro :Hygromycin B 耐受基因 
      GFP:GFP報告基因 

      RFP:RFP報告基因 

      報告基因GFP/RFP可以幫助評價轉染效率和指示RNAi發生位點



      本公司共可構建11種RNAi Vector,分別為pGPU6, pGPH1, pGPU6/Neo, pGPH1/Neo, pGPU6/Hygro, pGPH1/Hygro, pGPU6/GFP/Neo, pGPH1/GFP/Neo,pGPU6/RFP/Neo, pGPH1/RFP/Neo,pGPU6/mCherry/Puro。

      其中pGPU6, pGPH1為無篩選標記RNAi載體;

      pGPU6/Neo, pGPH1/Neo, pGPU6/Hygro, pGPH1/Hygro為含抗性篩選標記Neomycin和Hygromycin的RNAi載體;

      pGPU6/GFP/Neo, pGPH1/GFP/Neo分別為含抗性篩選標記Neomycin同時可以表達GFP蛋白的RNAi載體;

      pGPU6/RFP/Neo, pGPH1/RFP/Neo分別為含抗性篩選標記Neomycin同時可以表達RFP蛋白的RNAi載體。


      11種RNAi Vector載體圖譜如下:














      每套載體均包括線狀或環狀shRNA表達載體,并為您提供整體的解決方案。

      質粒表達載體套裝

      針對目的基因設計并制備4個shRNA載體,細胞轉染效率達到70%以上,確保4個shRNA中,至少一個,在mRNA水平的基因的抑制效率在70%以上.


      套裝組成 數量
      針對目的基因的shRNA載體 4個
      陽性對照shRNA載體 1個
      陰性對照shRNA載體 1個
      注:套裝中所有質粒提供量為50ug

       

      目錄號 產品名稱 規格 價格 交貨期限
      C01001 SuperSilencing? shRNA質粒表達載體套裝> 1 套 ¥2,600 2周

       

      目錄號 產品名稱 規格 價格 交貨期限
      C03001 GAPDH SuperSilencing shRNA? 質粒表達載體 50ug ¥199 1周
      C03002 Negative Control SuperSilencing shRNA? 質粒表達載體 50ug ¥199 1周

       我們可以幫您將編碼目標shRNA 的DNA插入質粒,并做序列正確性檢測,您只需告訴我們靶基因序列或Gene ID號和希望插入載體的名稱,我們來幫您構建。我們為您提供足夠使用的純化的編碼您的目的shRNA的表達質粒。

      目錄號 產品名稱 規格 價格 交貨期限
      C02001 ShRNA質粒表達載體 (pGPU6) 50μg ¥599 2周
      C02002 ShRNA質粒表達載體 (pGPH1) 50μg ¥599 2周
      C02003 ShRNA質粒表達載體 (pGPU6/Neo) 50μg ¥599 2周
      C02004 ShRNA質粒表達載體 (pGPH1/Neo) 50μg ¥599 2周
      C02005 ShRNA質粒表達載體 (pGPU6/Hygro) 50μg ¥599 2周
      C02006 ShRNA質粒表達載體 (pGPH1/Hygro) 50μg ¥599 2周
      C02007 ShRNA質粒表達載體 (pGPU6/GFP/Neo) 50μg ¥599 2周
      C02008 ShRNA質粒表達載體 (pGPH1/GFP/Neo) 50μg ¥599 2周
      C02009 ShRNA質粒表達載體 (pGPU6/RFP/Neo) 50μg ¥599 2周
      C02010 ShRNA質粒表達載體 (pGPH1/RFP/Neo ) 50μg ¥599 2周


      如果您選擇吉瑪公司的Validated SuperSilencing shRNATM 質粒表達載體,吉瑪提供配套的陰性對照質粒,陰性對照質粒是RNA干擾試驗所必須的,一個好的GAPDH陽性對照載體,可以讓您試驗體系更加穩定,也可以檢測試驗中可能出現的問題。

      客戶將siRNA片段克隆到目的表達載體后,需制備大量高純度或無內毒素的質粒進行下一步實驗,為此吉瑪公司推出制備高純度質粒的服務。


      功能介紹與實驗實例

      shRNA細胞轉染實驗實例

      一、 細胞培養

      人胚腎細胞293T,常規培養使用含10% FBS (Gibco)的DMEM培養基(Gibco)(含1.5 mM L-Glutamine, 3.7 g/L NaHCO3, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml Streptomycin)中,37oC 5% CO2飽和濕度培養箱中培養。

      二、 GAPDH siRNA片段的設計與合成

      人GAPDH的干擾序列信息見表1。實驗所用shRNA的設計由吉瑪公司(GenePharma, Shanghai)提供服務。
      表1 GAPDH基因的靶點序列

      shRNA Strand sequence
      GAPDH target
      NC 5'- UUCUCCGAACGUGUCACGU -3

      寡核苷酸的設計

      shRNA模板中的loop結構選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號,shRNA的轉錄終止序列采用T6結構。正義鏈模板的5'端添加了CACC,與BbsI酶切后形成的粘端互補;反義鏈模板的5'端添加了GATC,與BamHI酶切后形成的粘端互補;如果siRNA的第一個堿基不是G,則在CACC后補加一個G。

      Negative Control-S:
      5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGT TTCAAGAGA ACGTGACACGTTCGGAGAA TTTTTT G-3'
      Negative Control- AS:
      5'-GATC CAAAAAA TTCTCCGAACGTGTCACGT TCTCTTGAA ACGTGACACGTTCGGAGAAC-3'


      pGPU6/GFP/Neo-shRNA載體的構建

      1. 按照如下體系進行載體的連接反應:
      Components Volume (ul)
      10×T4 Ligation Buffer 2
      pGPU6/GFP/Neo(Bbs?I+BamH I) 1
      shRNA template( 20nM) 1
      T4 DNA ligase( 5 weissU/ul) 1
      ddH2O 15
      Total 20

      2.? 22℃ 反應1hr, 將連接產物轉化到感受態細胞中。

      3.?每個連接反應挑取5個菌落,接種到含50 ug/ml Kanamycin的LB培養集中。

      4. 使用堿裂解法抽提質粒,所得質粒用BamH I, Pst I分別酶切鑒定。
      5. 陽性重組載體送去測序。

      、 shRNA質粒的轉染

      實驗材料及試劑


      人胚腎細胞293T(常規培養于6 cm培養皿中)
      DMEM培養基+10% FBS
      D-Hank's Solution
      Trypsin-EDTA Solution (0.25% Trypsin +0.53 mM EDTA, Hyclone)
      Lipofectamin2000轉染試劑(Invitrogen)
      Opti-MEM I Reduced serum medium(Gibco)
      無抗生素的DMEM培養基
      12孔板 (Corning)

      步驟

      1. 293T細胞在10 cm培養皿中培養至80-90%融合時,接種12孔板。
      2. 傾去培養液,用5 ml D-Hank's solution洗滌細胞兩次。
      3. 加入2 ml Trypsin-EDTA solution, 混勻后,37oC放置3-5分鐘。
      4. 小心吸去胰酶溶液,在加入2 ml 含10% FBS的DMEM培養液,吹打使細胞形成單細胞懸液。
      5. 血球計數板計數,將細胞稀釋至5×105細胞/ml。
      6. 按2.5×105細胞/孔的濃度接種12孔板,混勻后于37oC 5% CO2培養24小時。
      7. 在1.5 ml EP管中加入100 μl Opti-MEM I,再加入2μg質粒,取另一1.5mlEP管,加入100μl Opti-MEM I,加入4μl Lipofectamin2000,混勻,室溫放置5分鐘后將兩管混合,室溫放置20~30分鐘。
      8. 吸去12孔板中的培養液,每孔加入800 μl無血清的DMEM培養液。
      9. 將轉染混合物逐滴加入12孔板中,混勻后,在培養箱中溫育4-6小時。
      10. 吸棄轉染液,加入1ml含10% FBS的DMEM培養液。37oC 5% CO2繼續培養24-48小時。
      11. 所得細胞用于RNA抽提并進行后續RT-PCR以及Western Blot檢測。

      實驗結果與分析

      細胞轉染結果

      以下為細胞轉染質粒后48小時的熒光照片,兩圖為同一視野。轉染效率在90%以上。


      總RNA的質量檢測

      轉染后24小時用Trizol法提取抽取細胞總RNA,所得RNA溶解于DEPC處理的ddH2O中。采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整度,采用分光光度法測定RNA的濃度和純度。實驗中所得樣品的OD260/OD280的值均在1.8-2.0范圍之內,并根據OD260計算濃度,調整RNA的濃度為500 ng/μl;瓊脂糖凝膠電泳結果(圖2)表示,28S rRNA與18S rRNA的亮度比值約為2:1,說明實驗中所抽提得到的總RNA質量較好,無降解,可以滿足后續實驗的要求。

      上圖總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結果(1×TAE)
      轉染后24小時細胞RNA樣品1,GAPDH干擾組;2,NC;3,Mock;4,Blank


      四、 Real-time PCR法檢測RNA干擾效果
      4.1 Homo-actin RNA Gene, GAPDH amplification Curves



      ?Sample.M actin RNA Gene.GAPDH gene amplification plots.

      3). Electrophoresis of PCR Products
      Electrophoresis of GAPDH gene PCR Products:
      Marker:50bp







      、 Western blot法檢測RNA干擾效果


      本實驗采用GAPDH單克隆抗體[GAPDH (G8795),SIGMA]來檢測不同條件處理樣本GAPDH的表達狀況。取轉染后48小時細胞,裂解后取蛋白進行實驗。
      結果與分析
      β-actin? ? ? ? ? ??


      GAPDH

      注:條帶從左至右共4個條帶,依次為1. 1 2. N 3. M 4. B


      表1 第一組Western blot結果的半定量灰度分析? ? ? ? ? ? ?

      組別 ACTIN GAPDH GAPDH/ACTIN rate to mock
      1 111290 8912.81 0.080086 0.098086
      N 94006.9 103993 1.106227 1.354853
      M 99911.6 81577.1 0.816493 1
      B 71434.8 56962.7 0.797408 0.976626

      使用方法

      GenePharma shRNA 表達載體使用說明
      ?
      在使用載體法針對某一基因進行 RNA干擾 研究過程中,通常會遇到如下幾個問題:實驗對照組的確立、細胞轉染條件的確定、基因抑制效率的檢測。??
      ??

      1、 實驗對照組的確立在一個完善的 RNA 干擾實驗設計中,必須考慮設立正確合理的實驗對照組。通常,這些對照組包括陰性對照、陽性對照、轉染試劑對照。

      陰性對照可以有兩種,一種是采用通用的陰性對照組, 在本試劑盒中包括了該對照所需的載體(shNC),可以表達與目的基因序列無同源性的 siRNA 片段;另一種是將目的 siRNA 的序列打亂后重新組合所得的陰性對照(scrambled)。

      陽性對照組的設立對于 RNA 干擾研究是很有必要的,尤其對于第一次接觸 RNA 干擾的用 戶而言。您可以利用陽性對照來確認RNAi 實驗中轉染、RNA 提取和基因表達檢測方法的可靠性。陽性對照通常采用已驗證的對某些基因有效抑制的 siRNA 片 段。本試劑盒中包括針對人 GAPDH 基因的表達載體(shGAPDH),該載體在導入細胞中后,可以有效抑制 GAPDH 基因的表達。吉瑪還向用戶提供其他的陽性對照以資選擇,詳細情況請參見本公司的產品目錄或《RNAi 產品使用手冊》。


      2、 細胞轉染條件的確定

      使用 DNA 載體轉染細胞時,為了選擇合適的轉染方法和確定轉染效率,通常采用報告基因來檢測 DNA 的導入情況。最常用的報告基因是綠色熒光蛋白。吉瑪公司提供的 shRNA 表達載體有一部分載體中包含綠色熒光蛋白的表達框架,轉入細胞后可以表轉染效率;如果您所定購的載體中不含綠色熒光蛋白的表達框架,您可以先 使用可 以表達綠色 熒光蛋 白的表達 載體來確定 轉染效率和轉染條件,然后使用同樣的條件來轉染 shRNA 表達載體。

      ?還用一種方法可以用于 確定轉染條件,就是采用陽性對照載體來轉染細胞(如 shGAPDH),檢測對照載體對基因的抑制效率,然后采用抑制效率較高時的轉染條件來進一步轉染 shRNA 表達載體。


      RNA?干擾實驗操作

      由于在 RNA 干擾實 驗中有多 種條件選 擇如試劑 和細胞 株等,在本實驗操作中以 shNC 為陰性對照,shGAPDH 為陽性對照,RNAi-Mate 為轉染試劑,Hela 細胞為實驗細胞株,按照上述條件分步闡述 RNA 干擾實驗的操作過程。如果用戶使用不同的細胞株和轉染試劑,可根據吉瑪公司的《RNAi 產品使用手冊》進行相應的調整。



      1??轉染條件的確定

      如果您所定購的載體中不含綠色熒光蛋白的表達框架,您可以先 使用可 以表達綠色 熒光蛋 白的表達 載體來確定 轉染效 率和轉染條件,然后使用同樣的條件來轉染 shRNA 表達載體。 還用一種方法可以用于 確定轉染條件,就是采用陽性對照載體來轉染細胞(如 shGAPDH),檢測對照載體對基因的抑制效率,然后采用抑制效率較高時的轉染條件來進一步轉染 shRNA 表達載體。?


      1、轉染前一天,接種 0.4-1.0×10 細胞/孔至 24 孔板中,加入 500μl 含血清培養液,37℃ 5% CO2 培養如果您選用可表達綠色熒光蛋白 的 pGPU6/GFP/NeopGPH1/GFP/Neo 載體,可以直接用這些載體來確定轉染效率;如果選用其他載體,可用其他表達綠色熒光蛋白的載體來確定轉染條件,或使 用 陽 性 對 照 載 體 如shGAPDH 來去 確 定 轉 染條件。 選用生理狀態良好的細胞對提高 轉染效 率很重 要。DNA的用量及其與轉染試劑的比例可在 推薦范圍 內適當調整。

      2、 在 50 μl Opti-MEM I 培養液或其它無血清培養液中加入 0.5-0.8μg DNA,混勻。
      3、 使用前輕輕混勻 RNAi-Mate 試劑,切忌離心處理。用 30μl 無血清的 DMEM 或 Opti-MEM,或其他無血清培養基)稀釋 1-4μg RNAi-Mate 試劑(可以分別設立 DNA/RNAi-Mate 的不同用量組,通常 DNA和 RNAi-Mate 的用量在 1:2-1:5 范圍內,針對不同的細胞需要不同的用量),輕輕混勻,室溫放置 5 分鐘。
      4、 將稀釋好的 siRNA 和 RNAi-Mate 試劑混合,定容到 100μl;輕柔混勻,室溫放置 30 分鐘,以便形成 siRNA/RNAi-Mate(或 DNA/RNAi-Mate)復合物。
      5、 將 100μl DNA/RNAi-Mate 復合物加到含有細胞和培養基的培養板的孔中,來回輕柔搖晃細胞培養板板,使 DNA/RNAi-Mate 混合物均勻覆蓋細胞。
      6、 細胞在 CO2 培養箱中 37℃溫育 24h-48h 后,進行轉染后的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感,孵育 4-6 小時后,除去復合物,更換培養基。
      7、 如果使用可以表達綠色熒光蛋白的 DNA 載體來檢測細胞的轉染效率,細胞轉染后 24-48 h 后,使用熒光顯微 鏡觀察計數表達綠色熒光蛋白的細胞,在明場觀 察計數同一視野中的總細胞數,轉染細胞率 =熒光蛋白表達細胞數/總細胞數×100%?;蚴褂?DAPI 等染料染核后,使用流式細胞儀進行計數,然后計算轉染效率。
      8、 也可使用陽性對照的抑制率來標定轉染效率。例如使用 shGAPDH 來抑制細胞內 GAPDH 基因的表達,如果轉染效率較高,shGAPDH 對 GAPDH 基因的 mRNA 和蛋白水平的抑制率通常分別為 50-90%和50-90%。反之,如果 shGAPDH 對 GAPDH 基因表現出較高的抑制率,也表明細胞的轉染效率較高,可以滿足進一步實驗需要。

      9、 如果在轉染條件摸 索實驗中沒有找到較高 效率的轉染方法,請更換轉 染方法和試劑。如無其他方 法選擇,可以 使用流式細胞儀將轉染的細胞分選出來用于后續實驗。如果 無法分選細胞,可以在計算 RNA干擾抑制效率時去除轉染效率的影響,也可以使用抗生素對轉染后的細胞進行初篩后再進一步檢測抑制效率。


      2??細胞的轉染

      1、 設定合理的實驗組,包括轉染試劑對照(mock transfection)、陰性對照(negative control)、陽性對照(positive control)和目的基因實驗組。

      2、 按照前面實驗確定的細胞接種量接種。37oC 5% CO2 培養至 40-70%融合。

      3、 按照前面實驗確定的轉染條件轉染細胞。如果需要轉染不同培養量的細胞,試劑的用量可以根據本公司《RNAi 產品使用手冊》第 9 頁和第 13 頁所述進行相應的變化。

      4、 轉染后 24-48h 后,收集細胞進行下一步的檢測工作。通常,目的基因在轉染后 24-48h 內就會表現出表達抑制,但有一些蛋白比如穩定性較強、半衰期較長的蛋白在轉染后含量降低比較緩慢,所以需要延長檢測時間。


      3??基因抑制效率的檢測

      1、 在本公司的《RNAi 產品使用手冊》 14 頁-19 頁)中較詳細地介紹了使用熒光定量 PCR 技術和 Westernblot 方法檢測目的基因表達變化的操作步驟和注意事項,用戶可以酌情選用。

      2、 用戶也可選用其他間接的方法(如目的基因的生物學功能或細胞生物學特性的變化)來檢測目的基因的抑制情況。鑒于這方面的檢測手段多種多樣,需要用戶自己進行選擇,在此不再贅述?

      產品說明書

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      1. RNA干擾研究工具
      2. MicroRNA研究工具?

      產品價格 本產品目錄中標示的價格均為國內統一零售參考價,全部為人民幣價格。如果大量定購時,在標準價格的基礎上有不同程度的優惠。?

      質量保證 凡吉瑪公司的產品均有嚴格的質量保證。如果我們發現確實存在質量問題時,保證更換產品。如果在到貨后一個月之內用戶無提出異議,我們將視本產品為優良產品而不再受理投訴事宜。提出產品異議(或投訴)時,切莫在產品使用完(或快使用完)后提出,以備本公司回收產品,確認產品質量。由于訂錯產品而產生的退貨情況,原則上由客戶承擔相關費用。發生投訴事宜時,公司只保證在產品價格額度范圍之內酌情賠償,恕不受理超過制品價格額度以上之部分。退款時需退還原始發票。


      我們保證:序列正確,符合設計原則; 質量(偏差±10%)和純度達標公司質控標準,轉染293T細胞無污染,單獨加質粒無明顯細胞毒性(配合轉染試劑引起除外)。

      shRNA載體:不保證轉染效率,不保證干擾效果。如果客戶根據有效siRNA序列,改成shRNA,存在無效風險,我們只保證序列正確,不保證干擾效果。

      shRNA載體套餐:1. 不保證轉染效率,轉染效率良好的情況下(>80%),保證mRNA水平70%干擾效果(下限偏差不超過5%),無效可以免費重新提供一次靶點(款到發貨)或退票退款或做預付款,如果重新合成款到發貨,再次無效,則不再接受投訴處理;

      2. 如果是提供蛋白結果,或者是lncRNA,或者非人和鼠的其他哺乳動物物種,只重合一次,重合還是無效也不再處理,客戶貨款正常支付。

      3. cirRNA、非哺乳動物或者其他不適合提供套餐服務的基因,不提供套餐,不保證干擾效果。


      備注:

      1.?以上無效需經過公司確認,如果驗證符合公司出貨標準,客戶仍需支付相關費用。

      2.?所有陽性或有效性確認,不同細胞表達調控不同,所以只需一種細胞或樣品確認效果即可,不保證所有細胞或樣品一定符合陽性結果。

      3.?所有實驗僅供科研使用。




      上海公司的聯絡方式如下:

      公司名稱:上海吉瑪制藥技術有限公司

      地址:上海市浦東新區哈雷路1011號9幢602室

      郵編:201203

      電話:021-51320195,021-51370738,021-51370739,4006900195

      E-mail:order@genepharma.com(產品訂購)support@genepharma.com(技術支持)

      上海、南京、浙江、安徽、云南、山東、福建、重慶、四川、貴州、西藏、陜西、甘肅、寧夏、新疆、青海、河南、山西、香港、澳門、臺灣以及其他境外客戶訂貨地區請聯系上海公司


      蘇州公司的聯絡方式如下:

      公司名稱:蘇州吉瑪基因股份有限公司

      地址:蘇州工業園區東平街199號

      郵編:215123

      電話:0512-86668828

      E-mail:szorder@genepharma.com(產品訂購)szsupport@genepharma.com(技術支持)

      北京、河北、內蒙古、天津、武漢、江西、黑龍江、吉林、遼寧、湖北、湖南、廣東、江蘇(除南京)、廣西、海南訂貨地區請聯系蘇州公司





      下單前請務必核對訂購表客戶信息和訂購內容無誤,訂單一經確認,當天即啟動生產。 超過當日17:00后不能修改或者取消,如果需要取消訂單,由此產生的費用,將由客戶承擔。

      【取消訂單費用規則】

      (1)當日17:00前,免費修改或取消。

      (2)當日17:00到次日17:00前,按該項產品金額的50%收取。

      (3)次日17:00后,按該項產品金額的100%收取。


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