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shRNA質粒載體
shRNA表達載體帶有抗生素標記,可以在細胞中持續抑制靶基因的表達,持續數星期甚至更久。對于一個已知有效的siRNA序列(例如,經過siRNA合成方法篩選獲得的),需要維持較長時間的基因沉默時,推薦使用shRNA載體系統。吉瑪致力于提供最先進和最方便的shRNA相關工具,最近推出新一代shRNA表達質粒,一種高效即用型載體,該載體在細胞內可以持續產生shRNAs,從而達到持久抑制目標基因表達的目的。
吉瑪 supersilencingTM shRNA表達載體系統
shRNA表達載體系統特點:
產生短發夾型RNA(shRNA)來完成RNA干擾
方法簡單、經濟實惠,只需合成DNA寡核苷酸克隆載體使用方便,帶有篩選標記
克隆載體使用方便,帶有篩選標記
shRNA質粒穩定,易于操作
RFP:RFP報告基因
報告基因GFP/RFP可以幫助評價轉染效率和指示RNAi發生位點
本公司共可構建11種RNAi Vector,分別為pGPU6, pGPH1, pGPU6/Neo, pGPH1/Neo, pGPU6/Hygro, pGPH1/Hygro, pGPU6/GFP/Neo, pGPH1/GFP/Neo,pGPU6/RFP/Neo, pGPH1/RFP/Neo,pGPU6/mCherry/Puro。
其中pGPU6, pGPH1為無篩選標記RNAi載體;
pGPU6/Neo, pGPH1/Neo, pGPU6/Hygro, pGPH1/Hygro為含抗性篩選標記Neomycin和Hygromycin的RNAi載體;
pGPU6/GFP/Neo, pGPH1/GFP/Neo分別為含抗性篩選標記Neomycin同時可以表達GFP蛋白的RNAi載體;
pGPU6/RFP/Neo, pGPH1/RFP/Neo分別為含抗性篩選標記Neomycin同時可以表達RFP蛋白的RNAi載體。
11種RNAi Vector載體圖譜如下:
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每套載體均包括線狀或環狀shRNA表達載體,并為您提供整體的解決方案。 |
套裝組成 | 數量 |
針對目的基因的shRNA載體 | 4個 |
陽性對照shRNA載體 | 1個 |
陰性對照shRNA載體 | 1個 |
注:套裝中所有質粒提供量為50ug |
目錄號 | 產品名稱 | 規格 | 價格 | 交貨期限 |
C01001 | SuperSilencing? shRNA質粒表達載體套裝> | 1 套 | ¥2,600 | 2周 |
目錄號 | 產品名稱 | 規格 | 價格 | 交貨期限 |
C03001 | GAPDH SuperSilencing shRNA? 質粒表達載體 | 50ug | ¥199 | 1周 |
C03002 | Negative Control SuperSilencing shRNA? 質粒表達載體 | 50ug | ¥199 | 1周 |
我們可以幫您將編碼目標shRNA 的DNA插入質粒,并做序列正確性檢測,您只需告訴我們靶基因序列或Gene ID號和希望插入載體的名稱,我們來幫您構建。我們為您提供足夠使用的純化的編碼您的目的shRNA的表達質粒。
目錄號 | 產品名稱 | 規格 | 價格 | 交貨期限 |
C02001 | ShRNA質粒表達載體 (pGPU6) | 50μg | ¥599 | 2周 |
C02002 | ShRNA質粒表達載體 (pGPH1) | 50μg | ¥599 | 2周 |
C02003 | ShRNA質粒表達載體 (pGPU6/Neo) | 50μg | ¥599 | 2周 |
C02004 | ShRNA質粒表達載體 (pGPH1/Neo) | 50μg | ¥599 | 2周 |
C02005 | ShRNA質粒表達載體 (pGPU6/Hygro) | 50μg | ¥599 | 2周 |
C02006 | ShRNA質粒表達載體 (pGPH1/Hygro) | 50μg | ¥599 | 2周 |
C02007 | ShRNA質粒表達載體 (pGPU6/GFP/Neo) | 50μg | ¥599 | 2周 |
C02008 | ShRNA質粒表達載體 (pGPH1/GFP/Neo) | 50μg | ¥599 | 2周 |
C02009 | ShRNA質粒表達載體 (pGPU6/RFP/Neo) | 50μg | ¥599 | 2周 |
C02010 | ShRNA質粒表達載體 (pGPH1/RFP/Neo ) | 50μg | ¥599 | 2周 |
shRNA細胞轉染實驗實例
一、 細胞培養
人胚腎細胞293T,常規培養使用含10% FBS (Gibco)的DMEM培養基(Gibco)(含1.5 mM L-Glutamine, 3.7 g/L NaHCO3, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml Streptomycin)中,37oC 5% CO2飽和濕度培養箱中培養。
二、 GAPDH siRNA片段的設計與合成
人GAPDH的干擾序列信息見表1。實驗所用shRNA的設計由吉瑪公司(GenePharma, Shanghai)提供服務。
表1 GAPDH基因的靶點序列
shRNA | Strand | sequence |
GAPDH | target | |
NC | 5'- UUCUCCGAACGUGUCACGU -3 |
Components | Volume (ul) |
10×T4 Ligation Buffer | 2 |
pGPU6/GFP/Neo(Bbs?I+BamH I) | 1 |
shRNA template( 20nM) | 1 |
T4 DNA ligase( 5 weissU/ul) | 1 |
ddH2O | 15 |
Total | 20 |
2.? 22℃ 反應1hr, 將連接產物轉化到感受態細胞中。
3.?每個連接反應挑取5個菌落,接種到含50 ug/ml Kanamycin的LB培養集中。
4. 使用堿裂解法抽提質粒,所得質粒用BamH I, Pst I分別酶切鑒定。實驗材料及試劑
上圖總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結果(1×TAE)
?Sample.M actin RNA Gene.GAPDH gene amplification plots.
3). Electrophoresis of PCR Products
五、 Western blot法檢測RNA干擾效果
GAPDH
注:條帶從左至右共4個條帶,依次為1. 1 2. N 3. M 4. B
表1 第一組Western blot結果的半定量灰度分析? ? ? ? ? ? ?
組別 | ACTIN | GAPDH | GAPDH/ACTIN | rate to mock |
1 | 111290 | 8912.81 | 0.080086 | 0.098086 |
N | 94006.9 | 103993 | 1.106227 | 1.354853 |
M | 99911.6 | 81577.1 | 0.816493 | 1 |
B | 71434.8 | 56962.7 | 0.797408 | 0.976626 |
1、 實驗對照組的確立在一個完善的 RNA 干擾實驗設計中,必須考慮設立正確合理的實驗對照組。通常,這些對照組包括陰性對照、陽性對照、轉染試劑對照。
陰性對照可以有兩種,一種是采用通用的陰性對照組, 在本試劑盒中包括了該對照所需的載體(shNC),可以表達與目的基因序列無同源性的 siRNA 片段;另一種是將目的 siRNA 的序列打亂后重新組合所得的陰性對照(scrambled)。
陽性對照組的設立對于 RNA 干擾研究是很有必要的,尤其對于第一次接觸 RNA 干擾的用 戶而言。您可以利用陽性對照來確認RNAi 實驗中轉染、RNA 提取和基因表達檢測方法的可靠性。陽性對照通常采用已驗證的對某些基因有效抑制的 siRNA 片 段。本試劑盒中包括針對人 GAPDH 基因的表達載體(shGAPDH),該載體在導入細胞中后,可以有效抑制 GAPDH 基因的表達。吉瑪還向用戶提供其他的陽性對照以資選擇,詳細情況請參見本公司的產品目錄或《RNAi 產品使用手冊》。
2、 細胞轉染條件的確定
使用 DNA 載體轉染細胞時,為了選擇合適的轉染方法和確定轉染效率,通常采用報告基因來檢測 DNA 的導入情況。最常用的報告基因是綠色熒光蛋白。吉瑪公司提供的 shRNA 表達載體有一部分載體中包含綠色熒光蛋白的表達框架,轉入細胞后可以表轉染效率;如果您所定購的載體中不含綠色熒光蛋白的表達框架,您可以先 使用可 以表達綠色 熒光蛋 白的表達 載體來確定 轉染效率和轉染條件,然后使用同樣的條件來轉染 shRNA 表達載體。
?還用一種方法可以用于 確定轉染條件,就是采用陽性對照載體來轉染細胞(如 shGAPDH),檢測對照載體對基因的抑制效率,然后采用抑制效率較高時的轉染條件來進一步轉染 shRNA 表達載體。
RNA?干擾實驗操作
由于在 RNA 干擾實 驗中有多 種條件選 擇如試劑 和細胞 株等,在本實驗操作中以 shNC 為陰性對照,shGAPDH 為陽性對照,RNAi-Mate 為轉染試劑,Hela 細胞為實驗細胞株,按照上述條件分步闡述 RNA 干擾實驗的操作過程。如果用戶使用不同的細胞株和轉染試劑,可根據吉瑪公司的《RNAi 產品使用手冊》進行相應的調整。
1??轉染條件的確定
如果您所定購的載體中不含綠色熒光蛋白的表達框架,您可以先 使用可 以表達綠色 熒光蛋 白的表達 載體來確定 轉染效 率和轉染條件,然后使用同樣的條件來轉染 shRNA 表達載體。 還用一種方法可以用于 確定轉染條件,就是采用陽性對照載體來轉染細胞(如 shGAPDH),檢測對照載體對基因的抑制效率,然后采用抑制效率較高時的轉染條件來進一步轉染 shRNA 表達載體。?
1、轉染前一天,接種 0.4-1.0×10 細胞/孔至 24 孔板中,加入 500μl 含血清培養液,37℃ 5% CO2 培養如果您選用可表達綠色熒光蛋白 的 pGPU6/GFP/Neo 或pGPH1/GFP/Neo 載體,可以直接用這些載體來確定轉染效率;如果選用其他載體,可用其他表達綠色熒光蛋白的載體來確定轉染條件,或使 用 陽 性 對 照 載 體 如shGAPDH 來去 確 定 轉 染條件。 選用生理狀態良好的細胞對提高 轉染效 率很重 要。DNA的用量及其與轉染試劑的比例可在 推薦范圍 內適當調整。
9、 如果在轉染條件摸 索實驗中沒有找到較高 效率的轉染方法,請更換轉 染方法和試劑。如無其他方 法選擇,可以 使用流式細胞儀將轉染的細胞分選出來用于后續實驗。如果 無法分選細胞,可以在計算 RNA干擾抑制效率時去除轉染效率的影響,也可以使用抗生素對轉染后的細胞進行初篩后再進一步檢測抑制效率。
2??細胞的轉染
1、 設定合理的實驗組,包括轉染試劑對照(mock transfection)、陰性對照(negative control)、陽性對照(positive control)和目的基因實驗組。
2、 按照前面實驗確定的細胞接種量接種。37oC 5% CO2 培養至 40-70%融合。
4、 轉染后 24-48h 后,收集細胞進行下一步的檢測工作。通常,目的基因在轉染后 24-48h 內就會表現出表達抑制,但有一些蛋白比如穩定性較強、半衰期較長的蛋白在轉染后含量降低比較緩慢,所以需要延長檢測時間。
3??基因抑制效率的檢測
1、 在本公司的《RNAi 產品使用手冊》 14 頁-19 頁)中較詳細地介紹了使用熒光定量 PCR 技術和 Westernblot 方法檢測目的基因表達變化的操作步驟和注意事項,用戶可以酌情選用。
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目錄分類 本商品目錄中的產品介紹按以下內容分類:
1. RNA干擾研究工具
2. MicroRNA研究工具?
產品價格 本產品目錄中標示的價格均為國內統一零售參考價,全部為人民幣價格。如果大量定購時,在標準價格的基礎上有不同程度的優惠。?
質量保證 凡吉瑪公司的產品均有嚴格的質量保證。如果我們發現確實存在質量問題時,保證更換產品。如果在到貨后一個月之內用戶無提出異議,我們將視本產品為優良產品而不再受理投訴事宜。提出產品異議(或投訴)時,切莫在產品使用完(或快使用完)后提出,以備本公司回收產品,確認產品質量。由于訂錯產品而產生的退貨情況,原則上由客戶承擔相關費用。發生投訴事宜時,公司只保證在產品價格額度范圍之內酌情賠償,恕不受理超過制品價格額度以上之部分。退款時需退還原始發票。
我們保證:序列正確,符合設計原則; 質量(偏差±10%)和純度達標公司質控標準,轉染293T細胞無污染,單獨加質粒無明顯細胞毒性(配合轉染試劑引起除外)。
shRNA載體:不保證轉染效率,不保證干擾效果。如果客戶根據有效siRNA序列,改成shRNA,存在無效風險,我們只保證序列正確,不保證干擾效果。
shRNA載體套餐:1. 不保證轉染效率,轉染效率良好的情況下(>80%),保證mRNA水平70%干擾效果(下限偏差不超過5%),無效可以免費重新提供一次靶點(款到發貨)或退票退款或做預付款,如果重新合成款到發貨,再次無效,則不再接受投訴處理;
2. 如果是提供蛋白結果,或者是lncRNA,或者非人和鼠的其他哺乳動物物種,只重合一次,重合還是無效也不再處理,客戶貨款正常支付。
3. cirRNA、非哺乳動物或者其他不適合提供套餐服務的基因,不提供套餐,不保證干擾效果。
備注:
1.?以上無效需經過公司確認,如果驗證符合公司出貨標準,客戶仍需支付相關費用。
2.?所有陽性或有效性確認,不同細胞表達調控不同,所以只需一種細胞或樣品確認效果即可,不保證所有細胞或樣品一定符合陽性結果。
3.?所有實驗僅供科研使用。
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