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公司產品
探針法RT-PCR定量產品
TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它設計與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。
TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它設計與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。
常用的熒光類型：
報告熒光：FAM、HEX、JOE、TET、VIC、NED、CY3、Texas Red、CT5
淬滅熒光：TAMARA、BHQ、MGB-NFQ
參比熒光：ROX
| 試劑盒組成（20μl?反應體系×100次） |
產品特點 |
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1、模板特異性高：只和目的擴增區結合發出信號，不和引物二聚體和非特異性擴增產物結合； 2、多重PCR檢測：可以標記不同的熒光基團，實現一管內多種基因擴增和檢測； 3、靈敏度高：可以檢測5000拷貝以下的基因定量，原因是當靶基因濃度較低時，染料法雖然也能檢測到信號，但幾乎以非特異性擴增信號為主，?結果不可靠；但探針法雖然信號不如染料法強，但完全是特異性擴增信號，結果是可靠的。 4、RT酶、 taq酶、 miRNA標準品、 逆轉錄引物、 特性定量引物、 探針溶液、 其他試劑、 質檢報告 |
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服務特點 |
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?1、您只需要提供您感興趣基因的GeneBank登錄號。 2、免費設計引物和探針服務。? 3、免費優化反應體系服務。? 4、免費實驗過程技術支持服務。 |
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試劑盒原理 |
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本試劑盒采用Displacement?probe和TaqMan熒光PCR基因檢測技術。 |
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探針法?Hairpin-it?miRNAs?qRT-PCR?定量試劑盒 |
目錄號 |
規格 |
價格 |
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E01011 |
50?rxns |
￥1100 |
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E01012 |
100?rxns |
￥1750 |
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E01013 |
200?rxns |
￥3300 |
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E01014 |
300rxns |
￥4400 |
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E01015 |
500?rxns |
￥6400 |
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探針法Hairpin-it?miRNAs定量和u6校準qRT-PCR試劑盒 |
E22006 |
50?rxns |
￥1760 |
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E22007 |
100?rxns |
￥2800 |
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E22008 |
200?rxns |
￥5300 |
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E22009 |
300rxns |
￥7000 |
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E22010 |
500?rxns |
￥10000 |
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探針法訂制基因qRT-PCR?定量試劑盒 |
E21006 |
50?rxns |
￥1100 |
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E21007 |
100?rxns |
￥1750 |
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E21008 |
200?rxns |
￥3300 |
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E21009 |
300rxns |
￥4400 |
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E22110 |
500?rxns |
￥6400 |
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引物探針套裝 |
F02002? |
1nmol |
￥850 |
實驗數據
SYBR染料法在實際運用過程中一個很大的問題就是引物二聚體的非特異性擴增信號對結果的干擾，尤其是在基因表達豐度不是很高的情況下，引物二聚體的信號甚至強過了目的產物擴增的信號，所以在設置反應條件時，會采用三步法來達到優化的目的，下面是一個優化示例：?
| 3?step?PCR | ?3?step?PCR |
| 標準程序 | 優化程序 |
| 95℃??5sec | 95℃??5sec |
| 55℃??30sec???? | ?60℃～64℃??30sec |
| 72℃??30sec（信號收集） | ??72℃～76℃??30sec（信號收集） |
將55℃提高至60℃～64℃是為了增加引物結合的特異性，信號收集時將72℃提高至72℃～76℃是為了盡量使引物二聚體打開，避免對目的信號的干擾。
而探針法一個顯著特點就是只有探針特異性和目的產物結合才能產生信號，非特異性擴增（包括引物二聚體結合）即便發生也無法產生信號，所以對反應程序的優化要比染料法簡單多了。通常采用兩步法，
【預變性】 95℃ 30 秒?
通常預變性時間為 30 秒，環狀質粒和基因組DNA 等難變性的模板可以延長至 1～2 分鐘，但時間過長酶容易失活，不推薦使用 2 分鐘以上的條件。?
【兩步法 PCR】?
| Step | 溫度 | 時間 | 說明 |
| 變性 | 95℃ | 3～5?秒 | Real?Time?PCR?擴增片段通常在?300?bp?以下，只需要?95℃、3～5?秒的變性設置。 |
| 退火/延伸 | 56～64℃ | 20～30?秒? ? | 首先采用?60℃、20?秒的條件設定，反應溫度可在?56～64℃范圍內進行調整。反應性能較差時，可以適當增加這一步的反應時間。 |
對taqman探針法熒光定量PCR儀通道的設置
使用熒光定量PCR儀器設置熒光通道時遵守的原則是：5’端FAM、3’端BHQ1的探針和SYBR Green I染料采用相同的設置，原因是FAM基團的熒光最大發射波長是518mM，這和SYBR Green I染料的最大發射波長是520nm非常相近，而單色熒光定量PCR儀此通道的發射波長范圍通常覆蓋了這個波長。
但有些熒光定量PCR儀器對熒光通道的選擇有著明確的規定，以ABI 7300為例，正常安裝濾光片后，每次上機會被要求設置合適的Reporter dye和quencher dye，其中Reporter dye可供選擇的基團有FAM、JOE、NED、VIC、ROX、SYBR，當客戶使用探針法時，需要根據探針5’端標記的發光基團作出對應的選擇；而客戶使用SYBR染料法時，選擇SYBR 就可以了。其中儀器quencher dye可供選擇的基團有TAMRA和NONE ，同樣當客戶使用探針法，需要根據探針3’端標記的淬滅基團作出選擇，當使用TAMRA作為淬滅基團時，因為TAMRA本身是一種熒光物質，在淬滅報告基團的同時，自身在更高波長處發射熒光，所以quencher dye要選擇TAMRA，以減少對報告基團的檢測造成的影響；當使用BHQ1、BHQ2、BHQ3、ECLIPSE作為淬滅基團時，因為這些基團不是熒光基團，所以quencher dye選擇NONE；而客戶使用SYBR染料法時，選擇NONE 就可以了。
1. 推薦逆轉錄反應體系（以Promega逆轉錄試劑為例）：
| 組份 | 終濃度 | 用量/反應 |
| 5×RT?Buffer | 1× | 4.0 μl |
| dNTP?(10 mM) | 0.375 mM | 0.75 μl |
| miRNA RT?Primer(1 μM) | 60 nM | 1.2 μl |
| RNasin?(40U/μl) | 0.5 U/μl | 0.25 μl |
| MML Reverse Transcriptase? (200U/μl) | 40 U | 0.20 μl |
| RNA Sample | 1-3 μg | X?μl |
| RNase Free H2O | — | To?20μl |
2. 推薦PCR實驗體系：
| 組份 | 終濃度 | 用量/反應 |
| 2×Real-time?PCR?Mix | 1× | 10 μl |
| miRNA Specific?Primer?Set(10 μM) | 0.2 μM | 0.40 μl |
| miRNA Specific?Probe?(10 μM) | 0.1?μM-0.2?μM | 0.20 μl-0.4?μl |
| rTaq?DNA?Polymerase?(5U/μl) | 1U | 0.20μl |
| cDNA? | — | 2.0μl |
| RNase free H2O | — | To?20μl |
*cDNA可根據實驗經驗做適當比例稀釋。
* miR Specific Primer Set 包括PCR正反向引物。
?
Real-Time PCR程序:95℃ 3min（根據自己的酶類型調整反應時間）
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95℃ 12s
40 cycles
60℃ 40s(采集熒光)
icroRNA-26a regulates tumorigenic properties of EZH2 in human lung carcinoma cells Cancer Genetics Volume 205, Issue 3, March 2012, Pages 113–123 ?Xiaomin Danga, Aiqun Mab, Lan Yanga, Hao Huc, Bo Zhua, Dong Shanga, Tianjun Chena, Yu Luod
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Notch3 regulates the activation of hepatic stellate cells[J]. World journal of gastroenterology: WJG, 2012, 18(12): 1397. Chen Y X, Weng Z H, Zhang S L.
目錄分類 本商品目錄中的產品介紹按以下內容分類：
1. RNA干擾研究工具
2. MicroRNA研究工具?
產品價格 本產品目錄中標示的價格均為國內統一零售參考價，全部為人民幣價格。如果大量定購時，在標準價格的基礎上有不同程度的優惠。?
質量保證 凡吉瑪公司的產品均有嚴格的質量保證。如果我們發現確實存在質量問題時，保證更換產品。如果在到貨后一個月之內用戶無提出異議，我們將視本產品為優良產品而不再受理投訴事宜。提出產品異議（或投訴）時，切莫在產品使用完（或快使用完）后提出，以備本公司回收產品，確認產品質量。由于訂錯產品而產生的退貨情況，原則上由客戶承擔相關費用。發生投訴事宜時，公司只保證在產品價格額度范圍之內酌情賠償，恕不受理超過制品價格額度以上之部分。退款時需退還原始發票。
效果承諾
出貨前標準品或含有基因樣品或客戶提供樣本驗證，其中一種方法可以檢測出目的基因。如果基因驗證不出來可以提供3對符合設計原則的引物各1nmol，正常付款結單或不出貨不付款結單。
l?引物套裝：如果客戶做不出來，我們再次檢測（客戶可以提供樣本），給客戶提供檢測報告確認后，重新給客戶提供一次引物，如果客戶還是做不出來，不再處理，客戶貨款正常支付。如我們驗證也無效，可退票退款或做預付款。
l?引物探針套裝：如果客戶做不出來，我們再次檢測（客戶可以提供樣本），給客戶提供檢測報告確認后，重新給客戶提供一次引物，如果客戶還是做不出來，不再處理，客戶貨款正常支付。如我們驗證也無效，可退票退款或做預付款。
l?試劑盒：如果客戶做不出來，我們再次檢測（客戶可以提供樣本），給客戶提供檢測報告確認后，重新給客戶提供一次引物，如果客戶還是做不出來，不再處理，客戶貨款正常支付。如我們驗證也無效，可退票退款或做預付款。
備注：
1. 以上無效需經過公司確認，如果驗證符合公司出貨標準，客戶仍需支付相關費用。
2. 所有陽性或有效性確認，不同細胞表達調控不同，所以只需一種細胞或樣品確認效果即可，不保證所有細胞或樣品一定符合陽性結果。
3. 所有實驗僅供科研使用。
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