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公司產品
熒光探針合成
吉瑪擁有處于國際領先水平的siRNA化學合成、定量PCR熒光探針合成及多種核苷酸化學修飾的全部核心技術，公司的技術隊伍以在國外留學和工作多年的資深學者領銜，由多位在該技術領域具有豐富經驗的博士和碩士組成。
熒光探針合成(Fluorescence Labeled Probe Oligos)
吉瑪擁有處于國際領先水平的siRNA化學合成、定量PCR熒光探針合成及多種核苷酸化學修飾的全部核心技術，公司的技術隊伍以在國外留學和工作多年的資深學者領銜，由多位在該技術領域具有豐富經驗的博士和碩士組成。
質量管理：我們所有的寡核苷酸都經過嚴格的合成監控與質量檢測，長度與標記由PAGE+HPLC來分析確認品質，確保無污染或部分標記或無標記探針的存在。
純度及長度：可根據要求進行除HPLC及PAGE之外的其它純化，長度7－40 mers 。
產品形式：產品以干粉形式貯運。
技術資料：包括合成的序列、純化方式、Epsilon消光系數值、oligo的分子量、數量（OD量及nmol數）
市面上常用的熒光基團和淬滅基團相匹配的探針組合
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淬滅基團種類 |
熒光報告基團種類 |
| DABCYL | 6-FAM，TET，JOE，HEX，Cy3等 |
| TAMRA | 6-FAM，TET，JOE，HEX等 |
| BHQ1 | 6-FAM，TET，JOE，HEX，Cy3等 |
| BHQ2 | TAMRA，Cy3，ROX，Texas Red等 |
| BHQ3 | Cy5，Cy5.5等 |
| Dye | Absorption wavelength | Emission wavelength | Colour |
| FAM | 495 | 520 | Green/yellow |
| TET | 525 | 550 | Orange/yellow |
| HEX | 535 | 565 | Pink |
| Quasar 570(cy3) | 550 | 570 | Dark pink |
| TAMRA | 550 | 575 | Red |
| ROX | 580 | 605 | Purple |
| CAL Fluor Red 610 | 590 | 610 | Orange /red |
| Quasar 670(cy5) | 650 | 670 | Blue |
經多年努力實踐，本公司掌握了從上游探針原料把控到下游探針產品合成等一系列成熟質量方案，所生產的探針產品基本上能夠滿足客戶要求，本公司產品詳情具體請見下圖各種探針修飾的搭配信息：
MGB原料為本公司新開發的新品，MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher) 本身不產生熒光，可以大大降低本底信號的強度。為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設計得更短， 既降低了合成成本，也使得探針設計的成功率大為提高，因為探針上接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團，可以將探針的Tm值提高5-10°C左右.
5'熒光報告基團
3'淬滅基團
5'熒光報告基團
3'淬滅基團
5'-FAM
3'-Dabcyl
5'-CY3
3'-BHQ-l
3'-BHQ-l
3'-BHQ-2
3'-TAMRA
5'-TAMRA
3'-BHQ-l
5'-HEX
3'-Dabcyl
3'-BHQ-2
3'-BHQ-l
5'-FAM
3'-MGB
3'-TAMRA
5'-HEX
3'-BHQ-2
5'-TET
5'-TET
3'-Dabcyl
CAL
Fluor Red 610
3'-BHQ-2
3'-BHQ-l
3'-TAMRA
3'-TAMRA
3'-BHQ-2
5'-CY5
3'-BHQ-2
免費贈送引物
TaqMan 探針是一探針，它設計與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。?
吉瑪公司Taqman探針標準曲線圖，擁有良好的線性范圍和靈敏度。 ? ? ? ? ? ? ? ? ??
Q-1 TaqMan探針的工作原理是什么？
? ? ? TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5’端，而淬滅基團則在3’末端。當探針與靶序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3’端的淬滅基團接近而被淬滅。在進行延伸反應時，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅基團分離，發射熒光。一分子的產物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產生。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此TaqMan探針檢測的是積累熒光。
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Q-2 TaqMan探針設計時應該遵循哪些原則？
1．擴增長度不應超過400bp，最好控制在70-150bp內，擴增片段越短，越容易獲得有效的擴增產物；
2. 探針應位于兩引物之間，探針的Tm值要比引物的Tm值高8-10℃，應在68-70℃之間；
3．探針所選序列應該高度特異，盡量選擇具有最小二級結構的擴增片段；
4．探針中堿基G、C的含量應在20％～80％之間
5．避免同種堿基成串出現，
6．堿基G不要出現在5’末端；
7．探針中堿基C的數量應多于堿基G，否則用其互補的序列；
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Q-3 探針標記的熒光基團和淬滅基團應該如何選擇？
? ? ? 當TaqMan探針完整時，5′端 的熒光物質受到 3′端的淬滅物質的制約，不能檢出熒光，所以探針的報告基團的發射波長要在淬滅基團的吸收波長范圍內。?
| 淬滅基團種類 | 淬滅基團性質 | 使用的報告基團種類 | |
| TAMRA | 熒光物質 | FAM,HEX,TET,JOE 等 | |
| ECLIPSE | 非熒光物質 | FAM,HEX,TET,JOE,TAMRA,ROX 等 | |
| BHQ系列染料 | BHQ0 | 非熒光物質 | BODIPY493/503,BODIPY FL 等 |
| BHQ1 | FAM,HEX,TET,JOE 等 | ||
| BHQ2 | CY3,TAMRA,ROX,Texas Red,CY5 等 | ||
| BHQ3 | CY5 等 | ||
Q-4 合成的探針應該如何定量？
? ? ? 由于核酸在260nm附近有此強吸收，因此常根據性質，用紫外分光光度計測定探針溶液在260nm的吸光度值，用OD值來表示。1OD是指：置于光路長度為1cm的比色皿中的DNA\RNA的量為1OD。
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Q-5 合成的探針應該如何保存？
?1. 熒光探針必須避光保存。
?2. 吉瑪提供數管已分裝的干品便于客戶貯存，干品可于-80℃保存半年以上，如無條件，請于-20℃保存。
?3. 強烈建議用RNase-free的TE(pH8.0)buffer溶解探針，這樣得到的探針溶液更穩定，保存時間更長。因為吉瑪提供分裝好的干品以避免探針溶液反復凍融，客戶可直接將探針配置成工作液(10μmol/L或20μmol/L)，同時分裝成幾分，暫時不用部分于-20℃保存。
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Q-6 TaqMan探針的實時定量PCR反應選擇什么條件？
用TaqMan探針進行實時定量RT-PCR需要優化的條件為?【預變性】 95℃ 30 秒?
通常預變性時間為 30 秒，環狀質粒和基因組DNA 等難變性的模板可以延長至 1～2 分鐘，但時間過長酶容易失活，不推薦使用 2 分鐘以上的條件。?
【兩步法 PCR】?
| 變性 | 95℃ | 3～5 秒 | Real Time PCR 擴增片段通常在 300 bp 以下，只需要 95℃、3～5 秒的變性設置。 |
| 退火/延伸 | 56～64℃ | 20～30 秒 | 首先采用 60℃、20 秒的條件設定，反應溫度可在 56～64℃范圍內進行調整。反應性能較差時，可以適當增加這一步的反應時間。 |
Q-7 TaqMan探針的實時定量PCR體系應該如何優化？
?用雜交探針進行實時定量RT-PCR需要優化的條件為：?
1）MgCl2的濃度：在4-8mM之間進行選擇。?
2）雜交探針的濃度：初實驗用0.2uM，如果熒光信號強度不足，可以增加至0.4uM。?
3）模板濃度設置：優化的擴增須進行一系列稀釋度的實驗，在條件有困難的情況下，至少要進行兩個稀釋度的測定。選用1pg-1ug的總RNA或是mRNA。?
4）對照設置：每個引物都要設無模板對照，陽性對照以及污染對照。?
PCR實驗步驟
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引物稀釋：?
根據引物標簽上的nmole量來稀釋引物，加入nmole量10倍體積的滅菌雙蒸去離子水即得100μM的儲存液，例如nmole=4.1，則加入41μl滅菌雙蒸去離子水即得到該引物濃度為100μM的儲存液。?
探針稀釋：?
同上述引物稀釋。?
推薦逆轉錄反應體系（以Promega逆轉錄試劑為例）：
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組份 |
終濃度 |
用量/反應 |
| 5×RT Buffer |
1× |
4.0 μl |
| dNTP (10 mM) |
0.375 mM |
0.75 μl |
| miRNA RT Primer(1 μM) |
60 nM |
1.20 μl |
| RNasin (40U/μl) |
0.5 U/μl |
0.25 μl |
| MML V Reverse Transcriptase (200U/μl) |
40 U |
0.20 μl |
| RNA Sample |
1-3 μg |
X?μl |
| RNase Free H2O |
— |
To 20μl |
逆轉錄程序：
26℃ 40 min；42℃ 40 min；85℃ 10min；4℃ hold.
推薦實驗體系：
| 組份 |
終濃度 |
用量/反應 |
| 2×Real-time PCR Master Mix（FAM）? |
1× |
10μl |
| miRNA specific?Primer set?(10μM) | ? 0.2?μM | ?0.4?μl |
| miRNA specific?Probe?(10μM) |
0.1?μM-0.2?μM |
0.20 μl-0.4?μl |
| rTaq DNA Polymerase (5U/μl) |
1 U |
0.20 μl |
|
cDNA |
— |
2μl |
| RNase Free H2O |
— |
To 20μl |
|
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Real-Time PCR程序:
95℃ 3min（根據自己的酶類型調整反應時間）
95℃ 12s
62℃?40?s?(采集熒光)
40 cycles
1. Bastian, I., S. Tam Tam, et al. "Differential expression of microRNA-1 in dorsal root ganglion neurons." Histochemistry and cell biology 135(1): 37-45.
2.Ma, H., Q. Lu, et al. "Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference." Genetics and Molecular Research 10(3): 1931-1941.?
3. Zou, Z., L. Wu, et al. "MicroRNA-30a sensitizes tumor cells to cis-platinum via suppressing beclin 1-mediated autophagy." Journal of Biological Chemistry 287(6): 4148-4156.
4. Li, N., J. Cui, et al. "Suppression of type I collagen expression by miR-29b via PI3K, Akt, and Sp1 pathway in Human Tenon’s Fibroblasts." Investigative Ophthalmology & Visual Science 53(3): 1670-1678.
5. Lan, Y., K. Zhao, et al. "Inhibition of porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus replication by short hairpin RNAs targeting of the nucleocapsid gene in a porcine kidney cell line." Journal of virological methods.
6.Gao, S., J. Yang, et al. "Pure curcumin decreases the expression of WT1 by upregulation of miR-15a and miR-16-1 in leukemic cells." Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 31(1): 27.
7. Zhang, X., Z. Liu, et al. "Neferine, an alkaloid ingredient in lotus seed embryo, inhibits proliferation of human osteosarcoma cells by promoting p38 MAPK-mediated p21 stabilization." European Journal of Pharmacology.
8. Bian, H. B., X. Pan, et al. "Upregulation of microRNA-451 increases cisplatin sensitivity of non-small cell lung cancer cell line (A549)." J Exp Clin Cancer Res 30(1): 20.
9. Sun, K., W. Wang, et al. "MicroRNA-221 inhibits CDKN1C/p57 expression in human colorectal carcinoma." Acta Pharmacologica Sinica 32(3): 375-384.
10. Xu, Z., J. Jiang, et al. "MicroRNA-181 Regulates CARM1 and Histone Aginine Methylation to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells." PloS one 8(1): e53146.?
目錄分類 本商品目錄中的產品介紹按以下內容分類：
1. RNA干擾研究工具
2. MicroRNA研究工具?
產品價格 本產品目錄中標示的價格均為國內統一零售參考價，全部為人民幣價格。如果大量定購時，在標準價格的基礎上有不同程度的優惠。?
質量保證 凡吉瑪公司的產品均有嚴格的質量保證。如果我們發現確實存在質量問題時，保證更換產品。如果在到貨后一個月之內用戶無提出異議，我們將視本產品為優良產品而不再受理投訴事宜。提出產品異議（或投訴）時，切莫在產品使用完（或快使用完）后提出，以備本公司回收產品，確認產品質量。由于訂錯產品而產生的退貨情況，原則上由客戶承擔相關費用。發生投訴事宜時，公司只保證在產品價格額度范圍之內酌情賠償，恕不受理超過制品價格額度以上之部分。退款時需退還原始發票。
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